Tres días antes de su muerte, en la fecha, ISABEL de Castilla añade un codicilo al testamento que ha dictado unas semanas antes, el 12 de octubre, de manera que, definitivamente, el testamento nombra heredera a su hija JUANA, y en caso de muerte de ésta o de alguna otra razón que imposibilite su correcta gobernación, al hijo de JUANA, nieto de ISABEL, el infante don CARLOS. En este último caso, designa como regente a su esposo don FERNANDO de Aragón, en tanto no cumpla los veinte años su nieto CARLOS. Queda claro, por los términos del testamento, la desconfianza de ISABEL a lo que pudiese suponer el gobierno de Castilla por un príncipe extranjero.

En la fecha, tras varios meses de enfermedad y muy afectada por la sucesión de desgracias familiares, muere en Medina del Campo la reina ISABEL a la edad de 53 años. El hecho de la muerte, de ISABEL la Católica tiene consecuencias trascendentales desde el punto de vista político, pues pone fin a la “unión” de Castilla y Aragón. En efecto, su marido FERNANDO de Aragón no tiene ya ningún derecho a ejercer el poder en Castilla y la corona recae en la heredera legítima, JUANA. FERNANDO se apoya en el codicilo añadido por ISABEL en su testamento tres días antes, y considera que “el mal de la cabeza” que padece su hija le impide gobernar, como ha previsto la reina Isabel y como señala la información de Martín de Múgica. En carta a FELIPE el Hermoso, FERNANDO el Católico concluye que la única solución es encerrar a JUANA en una fortaleza.