Fallece, a los treinta años de edad, víctima de la epidemia que tanto ha mermado la salud resentida de su esposo el rey, ANA de Austria. Ha sido la cuarta esposa de FELIPE II. La muerte de doña Ana marcará para siempre a FELIPE II. Le ha profesado un gran amor; nunca se volverá a casar. Muchos años después, ella seguirá presente en sus pensamientos, y la venerará como su gran mediadora ante la Divinidad.  De todas maneras, parece que planeó un nuevo matrimonio con la hermana de Ana, Margarita, cuarenta años más joven que él. Pero nunca se celebró este enlace, pues la joven profesó en las Descalzas Reales.

Para el valido de FELIPE III, el famoso Duque de Lerma, Francisco Gómez de SANDOVAL, lo único importante es su enriquecimiento personal y, para lograrlo, deja hundir en el caos y la inmoralidad la administración del Reino. En su afan de ejercer un dominio absoluto sobre el rey, y para evitar, por tanto, la influencia sobre FELIPE III de su madre ANA de Austria, y sobre todo de su tía, la emperatriz MARÍA de Habsburgo, hermana de su padre, y residente en el monasterio de las Descalzas Reales, convence al rey para trasladar la Corte de Madrid a Valladolid. Así, el 11 de enero de 1601 se hace público el traslado de la Corte a Valladolid, donde permanecerá hasta el 4 de marzo de 1606.